Palicki nasceu em Toledo, Ohio, filha de Nancy Lee (née francesa) e Jeffrey Arthur Palicki. Ela tem um irmão mais velho Eric, um escritor de quadrinhos que influenciou seu interesse em quadrinhos.
Ela era uma série regular nas primeiras três estações da série de drama da NBC Friday Night Lights de 2006 a 2009, retratando Tyra Collette. No início de 2011, ela voltou para os dois episódios finais da série.
Em 2003, Palicki também apareceu como Judy Robinson no piloto não vendido de John Woo, The Robinsons: Lost in Space. Em 2006, ela também apareceu no piloto da WB, Aquaman, como o malvado Nadia. O piloto não foi apanhado em série pela rede CW, resultado da fusão da rede WB e UPN, que ocorreu enquanto o piloto estava sendo filmado. Ela apareceu como Kara / Lindsey Harrison no final da temporada 3 de Smallville. Palicki apareceu em Supernatural como Jessica Moore, namorada condenada de Sam Winchester, que é morto por um demônio em seu episódio piloto. O personagem reaparece no episódio Supernatural da temporada 2, "O que é e o que nunca deveria ser", e o episódio da temporada 5 "Free To Be You and Me".
Ela fez uma aparição no video musical will.i.am "We Are the Ones" em apoio ao presidente da presidência de 2008, Barack Obama. Em 2010, Palicki se juntou ao drama de televisão FOX Lone Star, que foi cancelado após dois episódios, apesar de boas críticas. Em 2011, Palicki retratou Wonder Woman em um piloto de 2011 produzido por David E. Kelley para a NBC. O piloto não foi escolhido como uma série. Ela desempenhou o papel recorrente do Dr. Samantha Lake na primeira temporada da comédia Sobre um Menino em 2014, reunindo-se com o showrunner Friday Night Lights, Jason Katims.
Palicki estrelou Legion (2010) e co-estrelou em G.I. Joe: Retaliação (2013) na liderança do papel feminino de Lady Jaye. Ela também apareceu em papéis de apoio em Red Dawn (2012) e John Wick (2014). Embora inicialmente assinado para estrelar no filme de terror de Jamie Babbit 2012 Breaking the Girls, devido a atrasos de produção e agendamento de conflitos, ela não aparece no filme.
Em agosto de 2014, Palicki se juntou a Agents of S.H.I.E.L.D. em um papel recorrente como Barbara "Bobbi" Morse. Ela tornou-se um dos principais elos após a segunda metade da temporada 2, continuando até que seu personagem foi escrito fora da série perto do final da temporada 3. ABC ordenou um episódio piloto para um spin-off, Marvel's Most Wanted, caracterizando seu personagem no papel principal, mas não o desenvolveu como uma série.
Em julho de 2016, Palicki foi lançado como Kelly Grayson em The Orville, uma série de comédia e drama de ficção científica criada por Seth MacFarlane, que também é protagonista do capitão Mercer, o ex-marido de seu personagem.
Em 2016, Palicki e seu irmão, Eric, colaboraram na redação de seu primeiro livro de quadrinhos, intitulado No Angel, publicado pela Black Mask Studios. A primeira questão foi lançada em 30 de novembro de 2016.
Em setembro de 2014, seu representante confirmou que estava noiva do dublê Jackson Spidell, que conheceu no set de John Wick. Palicki cancelou o noivado em 2015.
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